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Epsin 1 Subisce Nucleocytosolic la spola e la sua Eps15 Interactiano Nh 2 - Terminal omologia (Enth) Dominio, strutturalmente simile alla Armadillo e Calore ripete, interagisce con il fattore di trascrizione leucemia promielocitica Zn 2 + Finger Protein (PLZF) astratto Epsin (Eps15 interattore) è una proteina citoplasmatica coinvolta nella endocitosi clatrina mediata attraverso le sue interazioni dirette con clatrina, l'adattatore clathrin AP-2, e Eps15. La porzione - Terminal NH 2 di epsin contiene un modulo filogeneticamente conservate di funzione sconosciuta, noto come il dominio ENTH (epsin NH 2 - Terminal omologia dominio). Ora abbiamo risolto la struttura cristallina di topo epsin 1 dominio ENTH a 1,8 & # x000c5; risoluzione. Questo dominio è strutturalmente simile al armadillo e ripete di calore di & # x003b2; beta-catenina e karyopherin - & # x003b2 ;, rispettivamente. Abbiamo inoltre identificato e caratterizzato l'interazione di epsin 1, tramite il dominio ENTH, con il fattore di trascrizione leucemia promielocitica Zn 2 + finger proteina (PLZF). Leptomycin B, un antibiotico antimicotico, che inibisce la via nucleare export dipendente Crm1-, induce un accumulo di epsin 1 nel nucleo. Questi risultati suggeriscono che epsin 1 può funzionare in un percorso di segnalazione che collega la macchina endocitico per la regolazione della funzione nucleare. Parole chiave: clathrin, Eps15 dominio di omologia, catenina, karyopherin, endocitosi introduzione Epsin (Eps15 Interactiano) proteine sono stati recentemente identificati come interagire partner per le EH (Eps15 omologia) domini di Eps15 (Chen et al 1998 & # x0003b;. Rosenthal et al., 1999). Sia epsin 1 e 2 interagiscono con i componenti del cappotto clathrin, parzialmente localizzano ai box clathrin rivestite, e sono coinvolti nella endocitosi clatrina-mediata (Chen et al 1998 & # x0003b;. Rosenthal et al., 1999). L'NH 2 - Terminal 140 aminoacidi di epsin costituiscono un modulo filogeneticamente conservato definito il dominio ENTH (epsin NH 2 - Terminal dominio di omologia & # x0003b; Kay et al., 1999), che si trova anche in proteine che sono sostanzialmente diversi da epsin dall'esterno di questo dominio (Chen et al 1998 & # x0003b;. Kay et al 1999 & # x0003b;.. Rosenthal et al 1999). Epsin legame Eps15 (. Salcini et al 1997), così come ad altre proteine dominio contenenti EH (Kay et al 1999 & # x0003b;.. Hussain et al 1999 & # x0003b;. Nakashima et al 1999 & # x0003b; Sengar et al. 1999), è mediata da asparagina-prolina-fenilalanina (NPF motivi), che si trova nel dominio COOH-terminale. La regione centrale di epsin contiene un clathrin consenso e più copie del DPW motivo di legame / F trova in genere in proteine che interagiscono con il & # x003b1; - adaptin subunità dell'adattatore clathrin AP-2 (Owen et al 1999 & # x0003b. ; Traub et al 1999).. Pertanto, epsin lega tramite questa regione sia clatrina e AP-2 (Chen et al 1998 e # x0003b;. Rosenthal et al., 1999). Epsin 1 è molto abbondante nel cervello e probabilmente partecipa riciclaggio membrana alla sinapsi (Chen et al. 1998). omologhi di lievito di epsin, Ent1p e Ent2p, hanno mostrato di essere coinvolti in funzione di endocitosi e actina (Wendland et al. 1999). I motivi NPF delle proteine Ent legano i domini EH di Pan1, che condivide somiglianze funzionali con Eps15 (Wendland et al. 1999). Sulla base di studi genetici, il dominio ENTH rappresenta la porzione funzionalmente più importante delle proteine Ent. Considerando che un ceppo ospitare una rottura di entrambi i geni Ent1 e Ent2 non è praticabile, espressione del dominio ENTH di una proteina in questo doppio fondo mutante, ma non espressione di ENTP mutanti di delezione privi di questo dominio, è stato sufficiente a salvare il fenotipo letale ( Wendland et al. 1999). Finora, la funzione del dominio ENTH è sconosciuta. Al fine di conoscere la sua funzione, abbiamo determinato la struttura cristallina ai raggi X del dominio ENTH di ratto epsin 1 e indagato le sue proprietà di legame alle proteine. I nostri risultati suggeriscono una duplice funzione inaspettata epsin nel citoplasma e nel nucleo. Materiali e metodi Espressione ENTH per determinazione strutturale ENTH di ratto epsin 1 è stato espresso come NH 2 - Terminal fusione GST utilizzando il vettore di espressione pGEX-6-1 (Amersham Pharmacia Biotech). Il plasmide è stato introdotto in B834 (DE3), le cellule (Novagen) e cresciuto nei media M9 definiti integrato con 50 mg / litro selenometionina (Semet & # x0003b; Leahy et al 1994.) E 0,1 mg / ml di ampicillina. Le cellule sono state coltivate ad una densità ottica di 2 misurata a 600 nm, momento in cui la coltura è stata indotta utilizzando 0,8 mM isopropil b-d - thiogalactopyranoside e lasciata continuare a crescere per & # x0223c; 4 & # x02013; 5 h. Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione, flash congelati e conservati a & # x02212; 80 & # x000b0; C. Purificazione di proteine è stata effettuata usando 60 g di cellule congelate risospese in 200 ml di 50 mM Tris-HCL, pH 7,5, 200 mM NaCl, 10 mM DTT, e 2 mM PMSF, e furono quindi omogeneizzata per sonicazione. Il lisato cellulare è stato pellettizzato per centrifugazione a 46.000 g e 4 e # x000b0; C per 50 min. Il surnatante è stato aggiunto al 3 ml di glutatione Sepharose 4B perline (Amersham Pharmacia Biotech). Mescolare delicatamente per 1 h, perline GST-Sepharose contenenti bound ENTH sono stati lavati quattro volte con 50 ml di tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, e 10 mM DTT). perline GST-Sepharose con bound ENTH sono stati poi risospese in 15 ml di tampone di lavaggio con & # x0223c; 100 & # x003bc; trombina bovina g e incubate durante la notte con l'agitazione. Come nota, anche se è un pGEX6-1 rTEV cleavable fusione GST vettore, abbiamo scoperto che rTEV scissione non è stato efficace. Tuttavia, si unirà trombina abbastanza bene in un interno del sito di 10 aminoacidi nel dominio ENTH. Cristalli di qualità inferiore sono stati ottenuti con rTEV proteine spaccati, ma questa proteina ha mostrato un notevole degrado delle vaschette cristallo, così studi con questi cristalli non sono stati perseguiti. proteine spaccati ENTH è stato separato da perline di glutatione-Sepharose e iniettato in un Superdex 75 16/60 colonna dimensione-esclusione (Amersham Pharmacia Biotech) a 0,5 ml / min in tampone di lavaggio. Le frazioni contenenti ENTH come determinato mediante assorbimento UV e SDS-PAGE sono riunite ed dializzati in 20 mM Na-Hepes, pH 7,5, 20 mM NaCl, e 10 mM DTT. ENTH era poi concentrata a & # x0223c; 7,5 mg / ml (Millipore ultrafree rotazione concentratore), flash congelato a 100 & # x003bc; l aliquote con azoto liquido e conservato a & # x02212; 80 & # x000b0; C. Cristallizzazione e raccolta dati cristalli iniziali sono stati ottenuti per impiccagione goccia diffusione del vapore a 20 & # x000b0; C. 1 e # x003bc; l di soluzione proteica a & # x0223c; 7,5 mg / ml è stato mescolato con 1 e # x003bc; l di soluzione madre contenente 100 mM Na-Hepes, pH 7,5, 10% di polietilene glicole (PEG) 1000, e l'8% di glicole etilenico su un vetrino di vetro siliconato, e equilibrata contro 0,5 ml di acqua madre. Cristalli di solito sono cresciuti a schermo intero (220 & # x000d7; 220 & # x000d7; 100 & # x003bc; m) a 30 & # x02013; 40 h. Cristalli stati crioprotetti mediante trasferimento sequenziale in acque madri contenenti 5% aumentando incrementi di etilene glicole ad una concentrazione finale del 30%. I cristalli sono stati poi lampeggiano congelati in liquido propano liquido raffreddato con azoto che è stata successivamente congelato in azoto liquido. ENTH cristallizzato nel gruppo spaziale P3 1 21 con una molecola per unità asimmetrica, e un contenuto di solvente di 40% come determinato dal coefficiente Matthews (Matthews 1968). dati di diffrazione sono stati raccolti in quattro lunghezze d'onda, e trattati con Denzo / scalepack (Otwinowski e Minore 1997 & # x0003b; Tabella). Cristallografici raccolta dati Statistiche struttura Determinazione Quattro dei cinque siti di selenio attesi si trovavano in una differenza Patterson mappa anomala calcolato alla lunghezza d'onda di picco utilizzando un Patterson pesante atomo metodo automatizzato di ricerca (Grosse-Kunstleve e Brunger, 1999), implementato nel Cristallografia & # x00026; NMR System (CNS & # x0003b;. Brunger et al 1998). Il sito finale è stato posizionato dopo Multiwavelength iniziale dispersione anomala (MAD) phasing con CNS utilizzando una mappa sfumatura log verosimiglianza (Bricogne 1997). Le statistiche phasing MAD sono stati eccellenti (Tabella). Le fasi sono state migliorate modifica la densità utilizzando flipping solvente (Abrahams e Leslie 1996) e l'istogramma corrispondente (Zhang e Main 1990 & # x0003b; Tabella). Una regione rappresentante della mappa densità elettronica risultante è mostrato in Fig. 1. catene laterali Quasi tutti sono stati chiaramente definiti nella mappa densità elettronica. Tutte mappa e fase calcoli sono stati effettuati utilizzando CNS (Brunger et al. 1998). Cristallografici Phasing Statistiche mappa Rappresentante sperimentale di elettroni densità di residui 30 & # x02013; 44, 72 & # x02013, 76, e 81 & # x02013; 85 sagomato a 1.4 & # x000c5; ottenuto con fasatura MAD e la successiva modifica della densità. Il raffinato modello finale è mostrato con una palla e bastone. Modello di costruzione e raffinatezza Un primo modello è stato costruito con il O programma (Jones et al. 1991), usando la mappa densità elettronica ottenuto per fasatura MAD e successive modifiche densità. Tutto il dominio ENTH potrebbe essere senza ambiguità risalire ad eccezione dei residui 1 & # x02013; 5, 20 & # x02013; 23, 149, e 150. Modello raffinatezza è stata monitorata utilizzando il valore R libero (Brunger 1992) calcolato da un casuale omesso il 10% dei i dati di diffrazione osservati. L'affinamento è stata effettuata utilizzando alternando cicli di ricottura simulata, dinamica molecolare angolo di torsione (riso e Brunger, 1994), trattenuti B fattore di affinamento (Hendrickson 1985), e il modello di ricostruzione. Modello raffinatezza è stata compiuta nel sistema nervoso centrale con l'obiettivo MLHL (Pannu e Read 1998) contro i dati di diffrazione alla lunghezza d'onda a distanza a basso consumo energetico. statistiche modello finale sono riportati nella tabella e sono stati calcolati usando CNS (Brunger et al. 1998) e Denzo (Otwinowski e Minor 1997). Il modello finale contiene residui di 16 & # x02013; 160 del dominio ENTH, 65 molecole d'acqua ordinate, e 3 molecole di glicole etilenico. Lievito schermo doppio ibrido Il dominio ENTH di ratto epsin 1 (aminoacidi 1 & # x02013; 160 di ratto epsin 1 & # x0003b;. Chen et al 1998) fusa al dominio di Lexa di legame al DNA è stato utilizzato come esca per lo screening di una libreria cervello di ratto dominio di attivazione Matchmaker in pGAD10 (Clontech Laboratories, Inc.). L'esca è stata trasformata con la libreria nella L40 ceppo giornalista lievito. colonie di lievito che sono sopravvissuti in istidina & # x02212; piatti sono stati anche testati per l'attivazione del gene LacZ. plasmidi Prey positivi per LacZ sono stati ritrasformati nel lievito. I cloni che non transactivate con il Lexa legame al DNA vettore da solo, ma interagito con il dominio ENTH-Lexa di legame al DNA, sono stati mappati restrizione e sequenziato. Una coppia di primer specifici per pGAD10 vettore: 5 & # x02032; CAT TTC GAT GAT GAA GAT ACC CCA CCA AAC C 3 & # x02032 ;, 5 & # x02032; GTG CAC GAT GCA CAG TTG AAG TGA ACT TGC 3 & # x02032; & # x0003b; sono stati utilizzati per la PCR degli inserti che sono stati sottoposti a mappatura di restrizione e analisi di sequenza. La specificità dell'interazione tra rPLZF & # x00394; POZ (vedere i risultati) con il dominio ENTH è stata ulteriormente confermata testando l'interazione di rPLZF & # x00394; dominio con dominio di attivazione ENTH-GAL4 POZ-Lexa DNA-binding nel lievito doppio ibrido saggio. mutanti di delezione di rPLZF & # x00394; POZ sono stati generati da amplificazione PCR dei frammenti desiderati, che sono stati subclonato nel pGAD424 dominio di attivazione vettore (Clontech Laboratories, Inc.). Purificazione Affinity Per affinità-purificazione di proteine di cervello di ratto, lo stesso dominio ENTH usato per studi cristallografici è stata accoppiata con UltraLink Biosupport Media (Pierce Chemical Co.) secondo le istruzioni del produttore. A Triton X-100 estratto di un totale di ratto cervello omogenato (10 mg / ml) è stato incubato con immobilizzato dominio ENTH a 4 e # x000b0; C e il materiale legato è stato analizzato mediante SDS-PAGE e Western blotting. Wild-type e mutante proteine di fusione GST-settimo sono stati utilizzati per la purificazione di affinità di Triton X-100 estratti di cellule trasfettate con la bandiera epitopi-tagged rPLZF & # x00394; POZ o full-length umana leucemia promielocitica Zn 2 + finger proteina (PLZF) secondo le procedure standard (al. Nemoto et 1997). Generazione di mutanti settimo Domini I domini ENTH mutanti sono stati ottenuti utilizzando la mutagenesi sito-diretta basato sulla PCR (Chen et al. 1999). Le sequenze di questi domini settimo mutanti sono stati confermati dalla norma sequenziamento doppio filamento. Leptomycin B Incubazioni Leptomycin B (10 ng / ml & # x0003b; gentile dono del Dr. M. Yoshida & # x0003b;. Kudo et al 1999) è stata aggiunta al terreno di coltura a 16 ore dopo la trasfezione e le cellule sono state incubate per ulteriori 3,5 ore prima fissazione. Una full-length GFP-tagged ratto epsin 1 clone è stato costruito come descritto (Rosenthal et al. 1999) e utilizzato negli studi leptomycin B. Anticorpi e cDNA Varie anticorpi policlonale di coniglio contro PLZF umana e epsin sono stati precedentemente descritti (Chen et al 1998 & # x0003b;. Grignani et al., 1998). anticorpi policlonale di coniglio contro PLZF ratto sono stati ottenuti utilizzando GST-rPLZF & # x00394; POZ come immunogeno. Il siero risultante è stato impoverito di anticorpi anti-GST da incubazione con perline GST e poi purificate per affinità con GST-rPLZF & # x00394; proteina di fusione POZ. Un cDNA codificante GFP - & # x003b2; galattosidasi proteina di fusione in pHM830 è stato un gentile dono del Dr. T. Stamminger (Istituto pelliccia Klinische und Molekulare Uirologie, Universitat Erlangen-Norimberga, Erlangen, Germania). Xpress-tagged epsin 1 cDNA è stato descritto in precedenza (Chen et al. 1998). Un essere umano PLZF cDNA in pcDNA3 è stato un gentile dono del Dr. P. G. Pelicci (Istituto Europeo di Oncologia, Milano, Italia). Il cDNA codificante GFP-ratto epsin 1 generato dal subcloning cDNA epsin 1 nel vettore pEGFP-C1 (Clontech Laboratories, Inc.). Procedure Varie Cellule trasfezione, immunoprecipitazione, immunofluorescenza, produzione GST-proteina di fusione, SDS-PAGE, Western blotting, e dosaggio di proteine sono stati effettuati come precedentemente descritto (Chen et al. 1998). risultati struttura Determinazione Il dominio ENTH di ratto epsin 1 (residui di 1 & # x02013; 160) è stato espresso come proteina GST-fusione in Escherichia coli. Dopo clivaggio della proteina di fusione e purificazione, cristalli del dominio ENTH stati ottenuti da appendere goccia diffusione del vapore in una condizione di polietilene-glicole a 4 e # x000b0; C. Semet-sostituito dominio ENTH cristallizzato in una condizione simile, e questi cristalli sono stati utilizzati per ulteriori studi. dati di diffrazione sono stati raccolti per un esperimento di MAD (Hendrickson 1991) utilizzando la radiazione di sincrotrone a quattro lunghezze d'onda intorno al bordo di assorbimento K selenio. Cristalli appartenevano al gruppo spaziale p3 1 21, con parametri di cella unità: a = b = 49.81 & # x000c5 ;, c = 99,97 & # x000c5 ;, & # x003b1; = & # X003b2; = 90 & # x000b0 ;, e & # x003b3; = 120 & # x000b0 ;. I cristalli contenevano & # x0223c; 40% di solvente e diffracted ad una distanza minima di 1,8 Bragg & # x000c5 ;. La mappa di densità di elettroni ottenuti dalle fasi MAD densità modificato era superba, e facilmente rintracciabile (Fig. 1). Il raffinato modello finale ha un valore di R libero (Brunger 1992) del 22,5% per tutte le riflessioni con una spaziatura Bragg & # x0003e; 1.8 & # x000c5 ;. Caratteristiche generali della struttura Il dominio ENTH forma un compatto dominio globulare (fig 2A e Fig. B.), Con un solvente superficie accessibile di & # x0223c; 8.200 & # x000c5 ;. La struttura è composta da otto & # x003b1; eliche collegate da anelli di varia lunghezza. La topologia generale della struttura è determinata da tre tornanti elicoidali (& # x003b1; 1 & # x02013; 2, & # x003b1; 3 & # x02013, 4, e & # x003b1; 6 & # x02013; 7) che sono impilati consecutivamente con un torsione mano destra. Questa sovrapposizione dà il dominio ENTH un aspetto rettangolare se visto di fronte (Fig. I 2 A e B i). Le due facce principali, una concava e convessa, sono costituiti in parallelo e # x003b1; eliche (Fig. 2 A). Il x003b1 COOH-terminale & #; elica (& # x003b1; 8) ripiega indietro attraverso il dominio, che incornicia il bordo inferiore perpendicolare al tornante centrale (& # x003b1; 3 & # x02013; 4). Dal lato opposto, loop che collegano & # x003b1; eliche 1 & # x02013; 2, 3 & # x02013, 4, e 6 & # x02013; 7 forma una proiezione conica, conferendo un aspetto a cuneo (Fig 2A i.). Struttura generale del dominio ENTH e allineamento di sequenze. A, i disegni del nastro del dominio ENTH. Il disegno a destra (ii) è legata al disegno sinistra (i) da 60 & # x000b0; la rotazione verso lo spettatore. Gli otto & # x003b1; eliche del dominio ENTH. La famiglia di dominio ENTH contiene diversi residui altamente conservati (Chen et al 1998 & # x0003b;.. Kay et al 1999 & # x0003b;. Rosenthal et al 1999 & # x0003b; Fig 2 C.). I residui più altamente conservate rientrano grosso modo in due classi: residui interni che sono coinvolti in imballaggio e quindi sono necessari per l'integrità strutturale, e residui di solventi accessibili che possono essere coinvolte in proteine & # x02013, interazioni proteina. Due grandi regioni di alta conservazione emergono sulla superficie molecolare: una patch grande formato principalmente da residui sul circuito 2 e & # x003b1; elica & # x003b1, 4, e una patch più piccolo è stato trovato vicino ad anello 7 (fig 2A Fig B. Fig C....). Allineamento strutturale e di confronto Una ricerca somiglianza strutturale con DALI (Holm e Sander 1993) proteine identificate che sono strutturalmente simili a ENTH, ma non riferito da sequenza primaria. La struttura ENTH è più simile a un segmento di ripetizione armadillo da & # x003b2; beta-catenina (Huber et al 1997 & # x0003b; Fig 3A e B Fig...), L'unità di ripetizione calore dal karyopherin - & # x003b2; (Importina - & # x003b2;. & # X0003b; Chook e Blobel 1999 & # x0003b; Cingolini et al 1999 & # x0003b; Fig 3C e Fig D..), E per la subunità ponteggio di proteine fosfatasi 2A (Groves et al . 1999). Sia Armadillo e ripete di calore sono proteine & # x02013; moduli di interazione proteina composti esclusivamente da & # x003b1; eliche, e formano strutture con due facce principali, una concava e una convessa. Armadillo e ripete HEAT si legano alle proteine bersaglio con la loro faccia concava (Huber et al 1997 & # x0003b;. Chook e Blobel 1999 & # x0003b; Cingolini et al 1999 & # x0003b;.. Groves et al 1999). sovrapposizione strutturale del dominio ENTH con entrambi i tipi di ripetizione allinea loro facce concave (Fig. 2 e Fig. 3), che contengono la più grande macchia di residui superficiali conservati (Vriend, 1990). La C & # x003b1; sovrapposizione di ENTH con karyopherin - & # x003b2; ha una radice quadrata differenza media (RMSD) di 1,5 & # x000c5 ;, mentre il C & # x003b1; sovrapposizione con & # x003b2; beta-catenina produce un RMSD di 1,8 & # x000c5 ;. L'allineamento di struttura simile pieghe della proteina. A, allineamento del dominio ENTH di epsin 1 (blu) con una porzione della ripetizione regione Armadillo di & # x003b2; beta-catenina (verde), mostrando una buona sovrapposizione globale tra & # x003b1; eliche nella zona centrale. L'isolamento di una proteina Binding ENTH Domain, PLZF La somiglianza strutturale del dominio ENTH di armadillo e ripete HEAT suggerisce che il dominio ENTH può interagire con altre proteine. Abbiamo cercato di potenziali partner vincolanti del dominio ENTH di ratto epsin 1 (residui di 1 & # x02013; 160) utilizzando il lievito metodo a due ibrido. Un costrutto esca costituita dal dominio ENTH fusa al dominio di legame al DNA di Lexa è stato utilizzato per lo screening di una libreria cDNA del cervello del ratto pGAD10. 20 dei cloni isolati dallo schermo erano tutti uguali e codificato una cornice di lettura aperta altamente omologhi (96% di identità) alla porzione COOH-terminale di PLZF umana (corrispondente agli amminoacidi 262 e # x02013; 673 della proteina umana). PLZF è un fattore di trascrizione che contiene un NH 2 - Terminal dominio BTB / POZ e nove C 2 H 2 motivi dita Zn 2+ (Li et al 1997 & # x0003b;. Fig. 4 A). L'interazione tra il dominio ENTH di epsin 1 e PLZF. A, Rappresentazione schematica di PLZF umana e dei frammenti PLZF ratto discussi in questo studio. I numeri indicano i numeri di aminoacidi. B, Interazione del GST-ENTH proteina di fusione del dominio con rPLZF & # x00394; POZ. . L'identificazione di un fattore di trascrizione come partner di interazione per il dominio ENTH di epsin 1 sembrava sorprendente in un primo momento, data la funzione nota di epsin 1 alla periferia delle cellule. Tuttavia, & # x003b2; beta-catenina proteine della famiglia, che contengono un modulo strutturalmente correlato, hanno una duplice funzione nella corteccia delle cellule e nel nucleo (Barth et al 1997 & # x0003b,. Willert e Nusse 1998). Inoltre, catenina p120, che contiene ripete Armadillo, si lega ad una POZ / BTB-Zn 2+ fattore dito contenente la trascrizione, Kaiso, che è omologa a PLZF (Daniel e Reynolds 1999). L'interazione di catenina p120 con Kaiso è mediata dalla ripetizione regione armadillo di p120, e dalla porzione COOH-terminale di Kaiso, corrispondente alla regione di PLZF selezionata dal lievito schermo doppio ibrido. Inoltre, in base alle proprietà di legame di frammenti di proteine, il 2+ regione dito Zn e sequenze a monte di entrambi Kaiso e PLZF sono necessari per l'interazione con catenina p120 e ENTH, rispettivamente (Daniel e Reynolds 1999 & # x0003b; e fig. 4 A). La somiglianza di questi due interazioni riflette probabilmente conservazione evolutiva. Abbiamo ipotizzato che epsin e PLZF sono partner fisiologici, e ha svolto ulteriori studi biochimici e funzionali per convalidare questa interazione. L'interazione biochimica della epsin e PLZF Per verificare l'interazione di PLZF e epsin, esperimenti di purificazione di affinità sono stati effettuati utilizzando dominio ENTH immobilizzato. Il dominio GST-ENTH, ma non GST da solo, in particolare ha mantenuto una bandiera-tag & # x02013; rPLZF & # x00394; frammento POZ (il frammento proteico del PLZF privo del dominio POZ, corrispondente al frammento isolato dal lievito schermo doppio ibrido) da estratto di cellule CHO trasfettate (Fig. 4 B). Inoltre, purificato dominio ENTH privo di GST coniugato a perline, ma non solo perline, interagito con PLZF endogena da un estratto di cervello di ratto (Fig. 4 C). Per determinare se epsin e PLZF interagiscono in vivo, esperimenti di immunoprecipitazione di estratti di cervello di ratto sono state effettuate. Antiepsin anticorpi, ma non il controllo IgG, coprecipitated PLZF, ma non p53 (un negativo di controllo & # x0003b; Fig. 4 D). Viceversa, anti PLZF-anticorpo, ma non IgG preimmune, epsin coprecipitated (Fig. 4 E), ma non p53 (non mostrato). Mentre epsin è presente nel citosol e in seguito concentrato alla sinapsi, PLZF ha dimostrato di essere localizzati prevalentemente nel nucleo (Ruthardt et al. 1998). Tuttavia, un pool citosolico di PLZF stata osservata mediante immunofluorescenza nel cervello (non mostrato). Per valutare ulteriormente la specificità del legame del dominio ENTH a PLZF, residui altamente conservati del dominio ENTH sono stati alterati da mutagenesi sito-specifica: T28 ad A, R72 ad A, e G88 a S. La mutazione di glicina in posizione 88 è stato in precedenza trovato conferire sensibilità alla temperatura alla funzione di lievito Ent1p (Wendland et al. 1999). Wild-type e mutante settimo domini sono stati espressi come proteine di fusione GST e utilizzate l'affinità purificare la bandiera con tag PLZF umano espresso in cellule CHO. Come mostrato nella fig. 4 F, wild-type, ma non domini settimo mutanti, tirato giù PLZF da estratti di cellule transfettate. Una proteina di controllo, clatrina, non è stato trattenuto da una qualsiasi di queste proteine di fusione. PLZF possono reclutare epsin al Nucleo Sulla base di immunofluorescenza, più epsin si trova nel citosol, anche dopo sovraespressione (Chen et al 1998 e # x0003b;.. Rosenthal ed altri 1999 & # x0003b; Fig. 5 A). L'interazione di epsin 1 con PLZF solleva la possibilità che epsin possono essere trovati nel nucleo in determinate condizioni. Aumentata espressione di PLZF può aumentare la frazione di epsin 1 localizzata nel nucleo e consentire la visualizzazione di un pool epsin nucleare mediante immunofluorescenza. Quando uno dei due full-length PLZF umano o rPLZF & # x00394; POZ sono stati overexpressed da trasfezione, entrambe le proteine parzialmente accumulati nel nucleo (Fig 5 A, e non mostrate.). Nelle cellule cotransfected con epsin 1 e PLZF, è stata osservata anche una piscina nucleare epsin (la concentrazione di epsin endogena è al di sotto rilevabilità con i nostri anticorpi & # x0003b; Chen et al., 1998). microscopio immunofluorescenza che dimostrano che epsin possono accumularsi nel nucleo. A, sovraespressione di PLZF umano induce un accumulo parziale epsin nel nucleo. cellule CHO sono state trasfettate con epsin solo, PLZF umano da solo, o. Abbiamo poi studiato se epsin fisiologicamente la spola tra il nucleo e il citoplasma. L'antibiotico antimicotico, leptomycin B, è stato recentemente dimostrato di bloccare la via CRM1-dipendente esportazione nucleare e per indurre un accumulo nucleare di diverse proteine che navetta tra il nucleo e il citoplasma (Nishi et al 1994 & # x0003b;. Kudo et al. 1999 & # x0003b; Van Hengel et al 1999).. Abbiamo esaminato se leptomycin B influenzato la distribuzione intracellulare di epsin in cellule CHO trasfettate sia con GFP-epsin 1 o Xpress-tag epsin 1. Come mostrato dalla Fig. 5 B, sia epsin 1 proteine di fusione accumulati nel nucleo, dopo incubazione con leptomycin B, ma non in cellule di controllo. Un GFP & # x02013; & # x003b2; proteina di fusione galattosidasi usato come controllo non accumula nel nucleo indipendentemente dalla presenza di leptomycin B. Discussione La struttura cristallina del dominio ENTH di epsin 1 ha rivelato una relazione con altri moduli di proteine ben caratterizzati che non avrebbero potuto essere previsti da amminico primario analisi della sequenza di acido. Il dominio ENTH adotta una piega sorprendentemente simile a quella di ripetizioni Armadillo e calore, due domini trovano in & # x003b2; beta-catenina e karyopherin, rispettivamente. somiglianza strutturale indica spesso somiglianza funzionale. Di conseguenza, abbiamo identificato le proprietà di epsin suggerendo che questa somiglianza è funzionalmente significativo. & # X003b2; catenina è stato scoperto come componente di un ponteggio citoscheletro sottostante la membrana plasmatica ed è pensato di svolgere un ruolo importante nella funzione del citoscheletro corticale (Tao et al 1996 e # x0003b;. Bullions e Levine 1998) . & # X003b2; beta-catenina è stato successivamente trovato per essere parte di un percorso di segnalazione dalla superficie cellulare al nucleo, la cosiddetta via di segnalazione Wnt. L'attivazione del percorso porta alla diminuita fosforilazione e la degradazione di & # x003b2, beta-catenina e il suo accumulo nel nucleo, dove si regola la trascrizione (Barth et al 1997 & # x0003b;. Willert e Nusse 1998 & # x0003b; Peifer e Polakis 2000). epsin mammiferi è stato identificato come un fattore accessorio endocitosi clatrina-mediata (Chen et al 1998 & # x0003b;. Kay et al 1999 & # x0003b;. Rosenthal et al., 1999) ei suoi omologhi in lievito, Ent1p e Ent2p, sono stati implicati sia in endocitosi e la funzione actina (Wendland et al. 1999). La piscina predominante epsin è localizzato nel citoplasma (Chen et al 1998 e # x0003b;. Rosenthal et al., 1999). Tuttavia, i nostri risultati dimostrano che presentano epsin lega un fattore di trascrizione, PLZF, e che può entrare nel nucleo. Più specificamente, l'accumulo nucleare epsin prodotto da leptomycin B dimostra che epsin navette fisiologicamente tra il citoplasma e il nucleo. Leptomycin B blocca il percorso di esportazione nucleocytosolic CRM1-dipendente (Nishi et al 1994 & # x0003b;. Kudo et al 1999 & # x0003b;.. Van Hengel et al 1999), ciò implica che l'accumulo nucleare di risultati epsin da uno squilibrio tra nucleare importazione e l'esportazione nucleare. Una possibilità interessante è che un'interazione regolamentata di epsin con componenti citosolici, possibilmente mediate dalla sua fosforilazione (Chen et al. 1999), può controllare il pool nucleare epsin e, tramite PLZF, la trascrizione di geni specifici. Il presente regolamento può verificarsi in risposta a stimoli esterni che attiva endocitosi. Questo scenario definisce un nuovo percorso normativo da parte della macchina endocitico al nucleo. Questi risultati sono convergenti con le recenti studi del legame alle proteine Eps15 epsin. Come nel caso della epsin, il ruolo Eps15 in endocitosi clatrina mediata è consolidata e il grosso Eps15 è localizzato nel citoplasma (Salcini et al 1997 e # x0003b;. Benmerah et al., 1998). Tuttavia, un ulteriore ruolo di Eps15 nella regolazione delle funzioni nucleari è emersa. Lo stesso dominio EH contenente regione Eps15 che lega epsin anche interagisce con Numb e RAB / Hrb (Salcini et al. 1997). Numb lega Mdm2, un regolatore negativo di p53 (Juven-Gershon et al 1998 & # x0003b;. Juven-Gershon e Oren 1999), dimostrando una connessione tra Eps15 e un fattore di trascrizione. RAB / Hrb è un cofattore per l'esportazione dal nucleo della Rev proteina HIV, ei domini EH di Eps15 collabora con RAB / Hrb nella funzione del percorso di esportazione Rev (al. Doria et 1999). Questo percorso di esportazione, a sua volta, è CRM1-dipendente (Ullman et al. 1997). Il ruolo di Eps15 come cofattore in esportazione nucleocytosolic solleva la possibilità che anche la somiglianza del dominio ENTH di epsin alle karyopherins può riflettere una certa relazione funzionale. I karyopherins sono proteine implicate nel trasporto merci e il riconoscimento attraverso l'involucro nucleare attraverso i loro domini di ripetizione di calore (Radu et al 1995 & # x0003b;. G & # x000f6; rlich 1998 & # x0003b; Pemberton et al 1998 & # x0003b;. Nakielny e Dreyfuss 1999). Sulla base di studi genetici, il dominio ENTH è il più importante dominio funzionale delle epsins lievito, Ent1p e Ent2p (Wendland et al. 1999). Dal momento che i residui delle proteine Ent che interagiscono con il lievito EH domini e clathrin sono localizzati al di fuori del dominio ENTH, il ruolo essenziale di questo dominio può riflettere la sua implicazione nelle funzioni nucleari. Questa possibilità è coerente con la nostra osservazione che almeno uno dei residui importanti per la funzione è richiesta anche il dominio ENTH di Ent1p per il legame di ratto epsin 1 domini ENTH al PLZF. Sebbene un ortologo evidente di PLZF non è presente in Saccharomyces cerevisiae. proteine con più dita Zn 2+ motivi simili a quelli di PLZF sono espresse da questo organismo. La somiglianza di PLZF a Kaiso, un altro fattore di trascrizione in precedenza dimostrato di impegnare la regione armadillo ripetizione di p120 catenina (Daniel e Reynolds 1999), indica che l'interazione di armadillo domini - repeat con questa famiglia di fattori di trascrizione è evolutivo conservato, e quindi probabile fisiologicamente importanti. L'interazione del dominio ENTH con un fattore di trascrizione non è mutuamente esclusivo con potenziali interazioni con altre proteine. Sulla base della proprietà del strutturalmente correlati armadillo e HEAT ripete di legare più partner (Barth et al 1997 & # x0003b;. Huber et al 1997 & # x0003b;. Willert e Nusse 1998 & # x0003b; Chook e Blobel 1999 & # x0003b ;. Cingolini et al 1999 & # x0003b;. Groves et al 1999), è probabile che anche il dominio ENTH può avere più interattori fisiologici. esperimenti di pull-down da cervello di ratto hanno dimostrato che la tubulina, e ad un coatomer misura inferiore (Rothman e Wieland 1996), possono legare dominio ENTH di epsin 1 (nostre osservazioni non pubblicate). Tuttavia, il possibile significato di queste interazioni è chiaro. domini settimo sono presenti non solo nelle proteine della famiglia epsin, ma anche di proteine che differiscono sostanzialmente da epsin di fuori di questo dominio (Chen et al 1998 & # x0003b;. Kay et al 1999 & # x0003b;. Rosenthal et al., 1999) . È interessante che certi motivi si trovano spesso in tali proteine. Oltre motivi NPF che legano domini EH (Salcini et al. 1997), AP-2 e motivi clatrina, nonché motivi FG, sono spesso presenti in essi (Kay et al. 1999). Ringraziamenti Le note Riferimenti Curr. 1997; 1998; 1997; Natura. 1992; 1998; Curr. Oncol. 1998; Natura. 1998; Chem. 1999; Natura. 1999; Natura. 1999; Mol. Cella. Biol. 1999; 1999; Natura. 1998; 1999; Cella. 1999; 1985; Scienza. 1991; Biol. 1993; Cella. 1997; Chem. 1999; 1991; Mol. Med. 1999; Mol. Cella. Biol. 1998; 1999; 1991; Proc. Natl. Sci. 1999; Chem. 1997; 1993; J. Mol. Biol. Cella. 1999; Chem. 1997; 1991; Chem. 1997; Cella. 1999; 1998; Curr. 1998; Scienza. 2000; Cella. 1995; Chem. 1999; Scienza. 1998; 1997; Nucleic Acids Res. Proc. Natl. Sci. 1999; Cella. 1997; Natl. Sci. 1999; J. Mol. 1990; Curr. 1998; 1990;
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